Experimento 9

Experimento 9.

Aislamiento del Glucógeno.

 

I. Objetivos:

1. Extraer el glucógeno presente en una muestra de hígado de pollo.

2. Caracteriz

ar mediante pruebas químicas el glucógeno extraído.

II. Marco Teórico:

El glucógeno es un polisacárido de la célula animal, que se encuentra en el hígado (10%) y músculos (2%).  La estructura del glucógeno y los polisacáridos similares se puede describir como una ramificación en forma de abanico de moléculas de gucopiranosa, por medio de enlaces 1-6 en los puntos de ramificación.

Estructura ramificada de glucógeno.

 Presenta ramificaciones cada 8-12 glucosas con una cadena muy larga (hasta 300.000 glucosas). Se requiere dos enzimas para su hidrólisis (Glucogenofosforilasa) y alfa (1-6) glucosidasas, dando lugar a unidades de glucosa.  Dado que los seres vivos requieren una parte constante de energía, una parte importante de metabolismo de los azucares esta relacionado con los procesos de formación de almidón y glucógeno y su posterior degradación.

Materiales 

• Tubos de ensayo (6)
• Vaso químico
• Plancha de calentamiento
• varilla de vidrio
• licuadora
• goteros

Reactivos:

• Solución amortiguadora de fosfato monobásico de sodio 0.1M de pH 7.4 se disuelven 1.38g fr NaH2PO4.H2O en 100ml de agua destilada y se ajusta el pH a 7.4 mediante la adición de hidróxido de sodio 0.1N.
• Solución de 2,6-diclorofenolindofenol al 0.02% en agua.
• Solución de azul de metileno al 0.02% acuoso
• Solución de malonato de sodio 0.1 M.
• Solución de azida de sodio 0.1M.
• Solución de succinato de sodio 0.2M
• Solución de cianuro de sodio 0.1M
• Hígado fresco
• Acetona.

Diseño Experimental 

experimento 8

Experimento 8

Determinación Cualitativa de Carbohidratos.

 Objetivos:

1.    Realizar pruebas cualitativas para detectar carbohidratos con base en la formación furfural.

2.    Ensayar la prueba para azúcares reductores.

3.    Realizar pruebas cualitativas para polisacáridos.

 Marco Teórico:

Los carbohidratos son compuestos orgánicos, formados primordialmente por carbono, hidrógeno y oxígeno.  Se encuentran en muchos productos naturales y son una de las fuentes principales de energía para los organismos quimiotróficos.

La unidad fundamental de los carbohidratos son los monosacáridos, estos son polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas.

Los monosacáridos se combinan, con la pérdida de moléculas de agua uniéndose mediante enlaces glicosídicos, formándose oligosacáridos y polisacáridos.

En presencia de ácidos  no oxidantes, los carbohidratos se deshidratan y forman  furfural si el monosacárido es una pentosa o hidróximetilfurfural, si el monosacárido es una hexosa.

Cuando la reacción de deshidratación se efectúa con la ayuda del ácido sulfúrico concentrado y el color se desarrolla con alfa naftol, la prueba se denomina reacción de Molisch.

Otra prueba basada en la formación de furfural es la prueba de Seliwanoff.  Esta prueba consiste en la reacción del resorcinol (1,3 dihidróxibenceno) con las cetosas deshidratadas por el HCI concentrado.  Se observa la formación de un complejo rojo.

La prueba de Bial se utiliza para identificar pentosas y consiste en calentar la pentosa con HCI conc. se forma furfural que se condensa con orcinol en presencia de iones férricos para dar un color verde azuloso.

Prueba para azúcares reductores: Las propiedades reductoras de los azúcares depende de la presencia de grupos aldehídos o cetonas, reales o potenciales.  Al calentar ciertas soluciones de azúcares, en presencia de determinados iones metálicos, el grupo carbonilo se oxida y el ión metálico se reduce.

Algunas de éstas pruebas son:  La de Benedict, que identifica carbohidratos en general y es positiva cuando se observa la aparición de un precipitado amarillo, anaranjado o rojo ladrillo; y la prueba de Barfoed, que es similar a la de Benedict, excepto que el reactivo es ligeramente ácido o sirve para detectar la presencia de monosacáridos.

Los polisacáridos son cadenas muy largas o polímeros de monosacáridos, lineales o ramificados.  Se dividen en heteropolisacáridos y homopolisacáridos dependiendo si la forman distintos o iguales unidades simples.

Algunos polisacáridos de reserva importante lo son el almidón formado por dos constituyentes: amilosa y amilopectina; y el glucógeno llamado “almidón animal”, se encuentra en el hígado y músculos.

Reactivos

Diseño Experimental

Experimento 7

Experimento 7.

Estudio de Inhibición de la Fenoloxidasa de la papa

 Objetivos:

a.    Determinar la actividad enzimática de la fenoloxidasa presente  en extractos de papa.

b.    Calcular la Km de la enzima de los datos de actividad enzimática, frente a diferentes concentraciones de sustrato.

c.    Estudiar el tipo de inhibición que ejerce el ácido benzoico sobre la actividad de la fenoloxidasa de la papa.

 Marco Teórico:

Las enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas.  Como catalizadores, las enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente.  No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.

La característica más sobresaliente de las enzimas es su elevada especificidad.  Esta es doble y explica que no se formen subproductos: (1) Especificidad de sustrato.  El sustrato (S) es la molécula sobre la que el enzima ejerce su acción catalítica. (2) Especificidad de acción.  Cada reacción está catalizada por un enzima específico.

La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición.

    E       +     S                         ES                         E      +     P

La velocidad de reacción está dada por la ecuación:

Donde V₀ es la velocidad inicial del proceso

             V₀ =   V_máx   [S]

                       K_M +  [S]

 [S] = concentración de sustrato

 K_M  =  constante de Michaelis – Menten

 V_máx  = velocidad máxima

Los estudios de inhibición enzimática clásica reversible implican el análisis gráfico de los recíprocos de las velocidades iniciales 1/V_o y de las concentraciones de sustrato 1/ [S]

Materiales 

Reactivos
Pirogalol INHALACION Labios, uñas y piel azulados, tos, vértigo, dolor de cabeza, dificultad respiratoria, náusea, jadeo, dolor de garganta. PIEL  PUEDE ABSORBERSE! Cambio de color local de la piel, enrojecimiento, dolor. (Para mayor información véase Inhalación). OJOS Enrojecimiento, dolor INGESTION Náusea, dolor abdominal, náusea, vómitos, debilidad. (Para mayor información véase Inhalación).	Citrato 0.1M Inhalación:        Puede causar irritación de la nariz y la garganta. Ingestión:       No se espera ningún efecto. Contacto con los ojos:     No se espera ningún efecto. piel:      No se espera ningún efecto
Acido benzoico INHALACION Tos.  PIEL  enrogesimiento OJOS  enrogesimiento dolor	Sulfato de Amonio Contacto con los ojos Causa irritación a los ojos. Contacto menor con la piel Si el producto químico esta expuesto al contacto con la piel

DISEÑO EXPERIMENTAL

Experimento #6

Experimento 6.

Actividad Enzimática de la Ureasa

         Objetivos:

• Al finalizar el experimento el estudiante estará en capacidad de:

•     Determinar la actividad enzimática de la Ureasa presente en la harina de soya.
•    Calcular la Km. de la enzima de los datos de actividad enzimática, frente a diferentes concentraciones de sustrato.

 Marco Teórico:

Las enzimas son moléculas de proteínas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar las reacciones químicas que tienen lugar en los tejidos vivos, disminuyendo el nivel de la energía de activación, propia de las reacciones.  Se entiende por energía de activación al valor de la energía que es necesario aplicar (en forma de calor, electricidad o radiación) para que dos moléculas determinadas colisionen y se produzca una reacción química entre ellas.

Características de la acción enzimática:

1-    Especificidad de Sustrato: El sustrato es la molécula sobre la que la enzima ejerce su acción catalítica.

2-    Especificidad de acción: Cada reacción esta catalizada por una enzima específica.

La acción Enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición.

E  +  S                 ES               E  + P

El sustito se une a la enzima a través de numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrogeno, electrostáticas, hidrófobas, etc., en un lugar especifico, el centro activo.  Este centro es una pequeña porción del la enzima constituido por una serie de animoácidos que interaccionan con el sustrato.

La Ureasa es una enzima que convierte la urea en amoniaco a pH neutro y se puede obtener de fuentes vegetales, específicamente de la harina de frijol de soya.  Participa en el  metabolismo del nitrógeno en plantas. Estas enzimas permiten el estudio de nitrógeno ureico presente en el plasma humano.

En el estudio de la actividad enzimática de la ureasa, se titula el amoníaco formado con ácido clorhídrico valorado y se reporta al actividad enzimática en  moles de producto formado por minuto.  Se verifican las siguientes reacciones.

                               Ureasa

 (NH2)2CO                                               2NH3      +      CO2

   Urea                                                 Amoniaco

NH3     +    H2O                                     NH4 OH

NH4OH  +  HCl                                        NH4Cl   +      H2O

Materiales y Reactivos.

 Urea 0.25 M

LIMITE DE EXPOSICION PERMITIDO:  NO ESTABLECIDO

SINTOMAS Y SIGNOS DE LA EXPOSICION:

PIEL: PUEDE CAUSAR IRRITACION EN CONTACTO PROLONGADO.

OJOS:  PUEDE CAUSAR IRRITACION .

INHLACION:  LA  INHALACION  REPETIDA Y PROLONGADA PUEDE CONDUCIR A IRRITACION RESPIRATORIA.

INGESTION: MUY BAJA TOXICIDAD POR INGESTION.    

Amortiguador: KH2PO4

nhalación: Causa irritación de nariz y tracto respiratorio superior, tos, laringitis, dolor de cabeza, náusea y 

vómito. La muerte puede  presentarse por inflamación, edema o espasmo de la laringe y bronquios, edema

pulmonar o neumonitis química. 

Contacto con ojos: Tanto en formas de cristales como en disolución, este compuesto es muy corrosivo. 

Contacto con la piel:  La irrita y en casos severos causa quemaduras químicas. 

Ingestión: Se ha observado en humanos que una ingestión de 2400 µg/Kg/día (dosis bajas o moderadas) 

genera quemaduras en tráquea y efectos gastrointestinales como náusea, vómito, ulceración, diarrea o 

constipación y pérdida de conciencia

 HCl 0.2 M,

 Inhalación:  Apartar al sujeto lo antes posible de la zona contaminada, transportarlo estirado, con el tronco elevado, a un lugar tranquilo, fresco y bien aireado. Reanimación respiratoria u oxígeno si fuera necesario. Evitar el enfriamiento (taparlo con una manta)Contacto con la piel:  Sin perder tiempo, llevar al sujeto completamente vestido bajo la ducha. Retirar 

los zapatos, los calcetines, la ropa manchada, lavar la piel alcanzada con agua corriente. Médico de urgencia en todos los casos. Evitar enfriamiento (taparlo con una manta), procurar ropas limpias. 

Puede efectuarse un lavado posterior con solución de bicarbonato sódico. 

Contacto con los ojos:  Oftalmólogo de urgencia en todos los casos. Prever un transporte urgente hacia un centro hospitalario. Sin perder tiempo, enjuagar los ojos con agua corriente durante 15 minutos, manteniendo los párpados ampliamente abiertos. Administrar  un colirio analgésico (oxibuprocaína) en caso de dificultad en abrir los párpados.

 azul de timol. 

- RIESGOS PARA LA SALUD
VÍAS DE ENTRADA SÍNTOMAS DEL LESIONADO PRIMEROS AUXILIOS
 INGESTIÓN ACCIDENTAL Puede provocar irritacion gastrointestinal De a beber inmediatamente agua o leche.vomito, diarrea y nauseas. Nunca de nada por la boca a una persona que se encuentre inconsciente.
CONTACTO CON LOS OJOS Irritación y ardor en los ojos. Lavar suavemente con agua corriente durante 15 min. abriendo ocasionalmente los párpados.
 CONTACTO CON LA PIEL Irritación y enrojecimiento de la piel. Lavar con agua corriente durante 15 min. al mismo tiempo quitarse la ropa contaminada y calzado. 
ABSORCIÓN No identificado No se dispone de información
 INHALACIÓN Irritación en las vías tractorespiratorias Traslade a un lugar con ventilación adecuada,Puede causar metemoglobinemia, cyanosis Si respira con dificultad suministrar oxigeno.taquicardia y en casos extremos la muerte. Solicite atención medica de inmediato

Diseño Experimental

Experimento 5

Electroforesis de proteínas del suero humano
en gel de poliacrilamida bajo condiciones
desnaturalizantes (sds-page)

 Objetivos

• conocer la importancia de la electroforesis
• Aprender en la preparación del gel  

INTRODUCCIÓN

Electroforesis

Electroforesis es la migración de moléculas cargadas en solución como respuesta a la presencia de un campo eléctrico. La velocidad de migración depende principalmente de la fuerza del campo, de la carga, forma, masa y tamaño de la molécula, así como de la fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el que las moléculas se estén moviendo. Como herramienta analítica, la electroforesis es rápida, sensible y simple. La electroforesis es ampliamente usada para estudiar propiedades de especies cargadas en solución, y como una técnica de separación.

Matrices de soporte

Generalmente la muestra es corrida en matrices como papel, acetato de celulosa, geles de almidón, agarosa ó poliacrilamida. La matriz inhibe la difusión osmótica, así como el mezclado producido por convección térmica., además proveee un registro del proceso electroforético ya que puede marcarse y usarse para mediciones, autoradiografía ó almacenamiento. Las matrices de soporte más ampliamente usadas (agarosa y poliacrilamida) proveen además, un medio para separar moléculas por tamaño, ya que son geles porosos y pueden actuar como tamices moleculares.

Separación de proteínas

Las proteínas son compuestos anfotéricos, por lo tanto su carga neta está determinada por el pH del medio en el que están suspendidas. En una solución con un pH por encima de su punto isoeléctrico, una proteína tiene una carga neta negativa y en un campo eléctrico migra hacia el ánodo, mientras que migrará hacia el cátodo a pHs por debajo de su punto isoeléctrico..

Separación de proteínas bajo condiciones desnaturalizantes

El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza proteínas “envolviendo” el esqueleto polipeptídico, la unión presenta una relación de masas 1,4:1. El SDS confiere carga negativa al polipéptido en relación a su longitud. Usualmente es necesario reducir los puentes disulfuro de las proteínas para permitir la unión cuantitativa del SDS, esto se lleva a cabo en caliente con 2-mercaptoetanol. En SDS-PAGE, la migración no es determinada por la carga eléctrica del polipéptido, sino por su peso molecular.

Sistemas de amortiguador continuos y discontinuos

Un sistema continuo tiene un gel de separación sencillo y usa el mismo amortiguador en los tanques y en el gel, en un sistema discontinuo, un gel de poro grande y no restrictivo, llamado gel de apiñamiento, es colocado en la parte superior del gel de separación, llamado gel de resolución. Cada gel está hecho con un amortiguador diferente, y el amortiguador de los tanques es diferente al de los geles. 

Geles de poliacrilamida

Los geles de poliacrilamida se obtiene polimerizando monómeros de acrilamida (CH₂=CHCONH₂) en cadenas largas y entrecruzándolas con un compuesto bifuncional como N,N’-metilenbisacrilamida ( CH₂(NHCOCH=CH₂)₂, usualmente llamada bisacrilamida). La polimerización es iniciada mediante la adición de persulfato de amonio ó riboflavina, y se usa N,N,N’,N’-tetrametilenetilendiamina (TEMED) como acelerador del proceso de polimerización. Ambos iniciadores de polimerización generan radicales libres, el persulfato de amonio espontáneamente en solución (enlace peróxido), y la riboflavina mediante fotodescomposicion. .

pH

Los límites prácticos de pH para realizar PAGE están entre pH 3 y 10, ya que algunas reacciones hidrolíticas (como desaminación) ocurren a pHs extremos. 

Las bandas pueden ser evidenciadas mediante diferentes métodos como tinción con colorantes, revelado “fotográfico”, autorradiografía ó con marcaje fluorescente. En la presente aplicación se usará marcaje con plata, método altamente sensible y rápido. Las bandas de proteína son fijadas en la posición final después de la electroforesis precipitando las proteínas con metanol y ácido acético, las bandas son sensibilizadas con tiosulfato de sodio, que mejora el contraste entre las bandas teñidas y el fondo del gel, posteriormente el gel se trata con nitrato de plata, los iones plata se complejan con la proteina, y en un paso posterior, similar al revelado fotográfico, los iones plata complejados sufren una reducción mucho mas rápida que los iones plata libres, formando partículas coloidales de plata en las dos superficies del gel, preferencialmente sobre las bandas de proteína, haciéndolas visibles. Los límites de detección son del orden de ng de proteina.

Electroforesis de proteínas del suero humano

Las proteínas presentes en el suero humano pueden agruparse en 4 fracciones dependiendo de su mobilidad electroforética: Albúminas, alpha, beta y gamma globulinas. La mayoría de las alpha y beta globulinas son sintetizadas en el hígado, mientras que las gamma globulinas son producidas por linfocitos y células plasmáticas.

MATERIALES Y EQUIPOS

Cámara de electroforesis
Fuente de voltaje
Enfriador a 4°C
 

Experimento # 4

Experimento 4.

Separación y cuantificación de fracciones proteínicas del suero.

I. Objetivos:

1.                        Aplicar la técnica de precipitación salina selectiva para separar las diferentes fracciones de proteína presentes en una mezcla.

2.                        Determinar el porcentaje de composición de una mezcla de proteína mediante análisis colorimétrico.

Introducción:

El suero es el líquido de color ámbar que se obtiene por centrifugación y o decantación de la sangre que se ha coagulado.  En el proceso de coagulación se separan todas las proteínas de la coagulación (fibrinógeno), conjuntamente con las células plasmáticas. 

La viscosidad del suero de debe en gran parte a la albúmina, que  constituye el 55% de las proteínas totales.  Junto con los electrolitos, la albúmina participa en la regulación del volumen sanguíneo, al evitar que el agua que forma parte de la sangre difunda hacia los espacios intersticiales; también participa en el transporte de ácidos grasos.  Las globulinas comprenden el 38% de las proteínas plasmáticas y corresponden a los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) que liberan las células plasmáticas.  La función anticuerpo representa un crucial mecanismo de defensa contra infecciones virales y bacterianas de los animales y el hombre.  Tres fracciones de globulinas (alfa, beta y gamma) se pueden cuantificar y caracterizar por fraccionamiento con soluciones salinas.

Materiales:

Reactivos.

Suero sanguíneo

· En caso de inhalación del producto: Suministrar aire fresco. En caso de trastornos, consultar al médico.

 piel: Aclarar con abundante agua.

En caso de irritaciones continuas de la piel, consultar un médico.

· En caso de con los ojos: Limpiar los ojos abiertos durante varios minutos con agua corriente

Cloruro de sodio

inhalación	:	Irritaciones en el tracto respiratorio superior. CL50 (inhalación - rata): > 42 g/m3 en una hora de exposición.
Contacto con La Piel	:	Irritaciones.
Contacto con los Ojos	:	Irritaciones. Posibles enrojecimiento y dolor.
Ingestión	:	Nocivo leve. Grandes dosis pueden causar náuseas, vómitos, diarrea y agotamiento. Deshidratación. Reacción inflamatoria en tracto gastrointestinal. Posibles convulsiones. DL50 (oral - rata): 3000 mg/kg.

Reactivo de Biureth

cardiopulmonario (RCP) si la victima n

o respira.  Recurir a atencion medica. 

Inhalacion:  Alto nivel de concentracion es irritante a el sistema respiratorio.  

Piel:    Contacto con el producto puede causar irritacion.  Contacto prolongado puede causar irritacion 

mas grave e dermatitis.  Este problema puede ser aumentado cuando el liquido es mantenido en 

contacto con piel via ropa y zapatos.  Remover ropa contaminada.  Lavar el area de la piel afectada 

con mucho jabon y agua.  

Ojos:  Contacto o alta concentracion de vapores pueden causar  irritacion y dolor.  Si la irritacion 

persiste, reciba atencion medica.  Lavar ojos con agua por 15 minutos mientras mantiene el ojo 

abierto.   

Ingestion:  El tragar de este producto puede resultar en irritacion de la  boca y el sistema estomacal, dolor 

estomacal con vomito.  Tambien puede incluir los sintomas vistos con Inhalacion. Si la victima 

esta conciente, dele mucha agua para beber.  NO induzca el vomito. 

Sulfato de sodio 

OJOS  Lavar los ojos con suficiente agua por lo menos 15 minutos.  Avisar al médico si se 

desarrolla la irritación.

PIEL  Quitar la ropa afectada, lavar la piel con suficiente agua y jabón (ducha) y poner ropa 

seca.  Llamar al médico si se desarrolla la irritación.

INGESTIÓN  Lavar la boca, dar suficiente agua para beber e inducir el vómito.  Si grandes cantidades 

son absorbidas llamar al médico.

INHALACIÓN Aire fresco, descanso, posición semirecta y enviarlo a la clínica hasta que recupere su 

respiración.

Procedimiento