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domingo, 21 de agosto de 2011

PUNTO ISOELECTRICO DE AMINOACIDOS Y PROTEÍNAS

.EXPERIMENTO 2

            PUNTO ISOELECTRICO DE AMINOACIDOS Y PROTEÍNAS 
 Objetivos:


   1.1.   Determinar los pKa de un aminoácido polar con carga y un aminoácido no polar, mediante titulación con álcali.

   1.2.   Estimar el punto isoeléctrico de los aminoácidos polares y no polares del gráfico de pH vs volumen de base.

   1.3.   Determinar el punto isoeléctrico de una proteína mediante  la técnica de precipitación.

2. Introducción:

            El punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el número de cargas positivas se iguala al número de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula. En el punto isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero (0). En los aminoáci­dos los grupos ionizables corresponden a grupos carboxilos, amino, fenólicos y tiólicos.

Aminoácido
Abrev
Letra
pKa1
pKa2
pKa3
Glicina
Gly
G
2.35
9.78

Alanita
Ala
A
2.35
9.87

Valina
Val
V
2.29
9.74

Leucina
Leu
L
2.33
9.74

Isoleucina
Ile
I
2.32
9.76

Metionina
Met
M
2.13
9.28

Prolina
Pro
P
1.95
10.64

Fenilalanina
Phe
F
2.20
9.31

Triptofano
Trp
W
2.46
9.41

Serina
Ser
S
2.19
9.21

Treonina
Thr
T
2.09
9.1

Asparragina
Asn
N
2.14
8.75

Glutamina
Gln
Q
2.17
9.13

Tirosina
Tyr
Y
2.20
9.21
10.46 Fenol
Cisterna
Cys
C
1.92
10.7
8.37 Sulfhidrilo
Lisina
Lys
K
2.16
9.06
10.54 ε-Amino
Arginina
Arg
R
1.82
8.99
12.48 Guanidinio
Histidina
His
H
1.80
9.33
6.04 Imidazol
Acido aspáratico
Asp
D
1.99
9.90
3.90  β-COOH
Acido glutámico
Glu
E
2.10
9.47
4.07  γ-COOH
               
TABLA 1: Valores de pKa de los grupos ionizables de los á-aminoácidos.
                 Fuente: http://www.qb.fcen.uba.ar/quimicabiologica/Tabla%20pKa.html

            El pI de los a-aminoácidos monoamino-monocarboxílicos, siempre está cercano a pH = 6. Este valor lo podemos calcular con la siguiente ecuación:

            El pI de los á-aminoácidos monoamino-dicarboxílicos se encuentra a un pH intermedio entre los valores de pKa de los grupos carboxílicos y en el caso de los á-aminoácidos diamino-monocarboxí­licos entre los valores de pKa de los grupos amino.

            Los puntos isoeléctricos proporcionan información útil para razonar sobre el comportamiento de los aminoácidos y proteínas en solución. Así, la presencia de grupos ionizables en éstas moléculas tiene importantes consecuencias sobre la solubilidad.

            Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las demás condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga neta y cristali­zan en forma de sales insolubles a ese pH.

3. Materiales y reactivos:

   3.1.   Buretas, soportes, pinzas de bureta, matraces de 125 mL y 250 mL, pipetas de 25 ml, potenciómetro de pH.

   3.2.   Soluciones de ác. glutámico y glicina al 0.5% en HCl 0.1M; NaOH 0.2M; HCl 2%; leche de vaca, de cajita; etanol 95%; éter.

4. Procedimiento:

   4.1. Titulación de aminoácidos:
              Coloque una alícuota de 25 ml de la solución de aa. en un vaso químico de 250 mL y proceda a titular con NaOH 0.2 M, con adiciones de 1.0 mL cada vez, midiendo el pH antes de cada adición con un potenciómetro de pH, hasta alcanzar el pH de 10. Grafique sus resultados y reporte los valores de pKa de los aminoácidos analizados y calcule el pI en cada caso.


       4.1.1. Punto isoeléctrico y solubilidad: Verifique la solubilidad de varios aminoácidos en el punto isoeléc­trico. Para ello, utilice una pequeña muestra de cristales del aa. y trátelo de disolver en soluciones de fosfato que se encuentren en el pH correspondiente al punto isoeléctrico. Compare sus resultados con la solubilidad en agua.


   4.2. Determinación del pI de la caseína de la leche.

              Mida 50 mL de leche y colóquelos en un vaso químico de 400 mL. Diluya con 150 mL de agua destilada. Titule con HCl al 2% hasta alcanzar el pH de 4.8 contra un potenciómetro de pH. Si se tiene cuidado, se observa fácilmente el punto en el cual empieza a precipitar la proteína de la leche (caseína). Se agita durante 10 minutos, se deja sedimentar media hora  y se anotan los resultados. 
            4.2.1. Separación de la caseína : (opcional) Se decanta el sobrenadante de la leche precipitada en el punto 4.2. El precipita­do se lava dos veces por suspensión con 100 mL de agua destilada y nueva decantación.  Se succiona toda el agua por filtración en embudo Büchner. El residuo húmedo se pasa a un vaso químico y se prepara una suspensión final de caseína en 50 mL de  etanol al 95% y se agita con fuerza durante 5 minutos y se decanta. Se repite otra vez el extracto con alcohol y luego se extrae dos veces con  30 mL de éter. NOTA: descarte el éter en un recipiente para residuos orgánicos. Se filtra la suspensión y se deseca sobre una placa porosa. Se debe obtener un polvo blanco muy ligero.

4. Cuestionario:

   4.1.   ¿Por qué no se alcanza el pH 1 con HCl 0.1M en las solucio­nes en las que se prepararon los aa.?

   4.2.   Compare los puntos isoeléctricos de la glicina y los péptidos glicil-glicina y glicil-glicil-glicina. ¿Qué concluye sobre estos resultados?

   4.3.   Por qué las moléculas con grupos ionizables se hacen menos solubles en el punto isoeléctrico.

   4.4.   En la precipitación de la caseína qué pasaría si se añade muy rápido el ácido y se alcanza un pH más bajo que 4.8. Qué se debe hacer en este caso?

4.5.    ¿Por qué es necesario lavar la caseína precipitada con alcohol (Etanol 95%) y éter.


























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